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Feb 28, 2024

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Nature Communications volumen 13, número de artículo: 4469 (2022) Cite este artículo 5548 Accesos 5 Citas 58 Detalles de Altmetric Metrics Los endoscopios de fibra ultrafinos sin lentes ofrecen una experiencia mínimamente invasiva.

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 4469 (2022) Citar este artículo

5548 Accesos

5 citas

58 altmétrico

Detalles de métricas

Los endoscopios de fibra ultrafinos sin lentes ofrecen una investigación mínimamente invasiva, pero en su mayoría funcionan como un tipo rígido debido a la necesidad de una calibración previa de una sonda de fibra. Además, la mayoría de las implementaciones funcionan en modo de fluorescencia en lugar de en modo de imágenes sin etiquetas, lo que las hace inadecuadas para el diagnóstico médico general. En este documento, presentamos un endoscopio de fibra ultrafino totalmente flexible que toma imágenes holográficas en 3D de tejidos no teñidos con una resolución espacial de 0,85 μm. Utilizando un haz de fibras desnudas tan delgado como 200 μm de diámetro, diseñamos una configuración de imágenes holográficas de Fourier sin lentes para detectar selectivamente reflejos débiles de tejidos biológicos, un paso crítico para la obtención de imágenes de reflectancia endoscópica sin etiquetas. Se desarrolla un algoritmo único para la reconstrucción de imágenes holográficas sin calibración, lo que nos permite obtener imágenes a través de un pasaje estrecho y curvo independientemente de la flexión de la fibra. Demostramos imágenes de reflectancia endoscópica de tejidos de intestino de rata sin teñir que son completamente invisibles para los endoscopios convencionales. El endoscopio propuesto acelerará un diagnóstico más preciso y más temprano que antes con complicaciones mínimas.

La microscopía óptica es una herramienta esencial para comprender la fisiología de los tejidos vivos debido a su alta resolución espacial, especificidad molecular y mínima invasividad1. Sin embargo, estos beneficios están fuera de alcance cuando los objetos objetivo se encuentran dentro de pasajes curvos o debajo de tejidos que dispersan la luz. Al visualizar estas áreas de difícil acceso, los endoscopios han revolucionado la práctica médica para el diagnóstico temprano de enfermedades. Durante la última década, se han desarrollado endoscopios con resolución microscópica para un diagnóstico más preciso y precoz2,3. Además, la demanda de endoscopios ultrafinos (con un diámetro de sonda muy por debajo de 1 mm) ha aumentado constantemente para minimizar las molestias y las complicaciones que conlleva la inserción de la sonda del endoscopio3,4,5,6,7.

La microscopía endoscópica suele emplear varias fibras ópticas como canales conductores de luz delgados y flexibles. Por ejemplo, se ha utilizado una única fibra óptica uniendo varios tipos de dispositivos de escaneo y elementos ópticos al lado distal de la fibra que mira hacia la muestra4,8,9,10. En esta configuración se han implementado imágenes multifotónicas4,9,11,12,13 y tomografía óptica coherente (OCT)14,15,16. Sin embargo, el escáner conectado a la fibra suele ser demasiado voluminoso para ser ultradelgado, aunque el diámetro de la fibra en sí sea pequeño. Se utilizan medios de guía de imágenes, como haces de fibras coherentes, para eliminar la necesidad de escáneres distales, lo que hace que la sonda del endoscopio sea más delgada y robusta. Los núcleos de fibras individuales del haz se utilizan como píxeles de imagen fijando ópticas de imagen a la punta del haz de fibras o haciendo contacto directo de la punta de la fibra con la superficie de la muestra17,18. En esta configuración, se ha implementado la modalidad de imágenes de fluorescencia de campo amplio para un diagnóstico médico rápido19,20. Y las imágenes de fluorescencia confocal se han obtenido mediante el escaneo de alta velocidad del foco en el lado proximal de la fibra fuera del sujeto, ya sea con17,21 o sin22 una lente distal. Un inconveniente crítico de esta configuración es su incapacidad para adquirir imágenes de reflectancia de tejidos biológicos sin etiquetas. La fuerte reflexión de la iluminación que se produce en los núcleos de las fibras coincide exactamente con señales de reflexión mucho más débiles de los tejidos biológicos. Esta es una de las razones principales por las que se utiliza ampliamente el modo de imágenes de fluorescencia, en el que la emisión de fluorescencia se puede separar del ruido de retrorreflexión mediante el uso de filtros de color. Dado que la mayoría de las imágenes de fluorescencia requieren tinción, su uso para el diagnóstico clínico general es limitado. Una solución sencilla para la obtención de imágenes de reflectancia intrínseca es introducir una fibra separada para la iluminación. Sin embargo, esto solo ha sido aplicable para imágenes macroscópicas debido al diámetro ampliado de la sonda y al bajo poder de resolución espacial limitado por la distancia entre la fibra y la muestra requerida para la iluminación separada.

Se han desarrollado varios tipos de endoscopios de fibra sin lentes para minimizar el tamaño de la sonda al diámetro de la propia fibra. Por ejemplo, se han empleado fibras ópticas multimodo como medio guía de imágenes23,24,25. Proporcionan numerosos modos espaciales independientes que pueden transferir información de la imagen a la vez. Dado que su densidad de modo de área es uno o dos órdenes de magnitud mayor que la densidad del núcleo de fibra en el haz de fibras, el diámetro de la sonda puede ser incluso más pequeño que la sonda del haz de fibras. Sin embargo, la mezcla de modos complejos oscurece la información de la imagen. Numerosos estudios recientes han demostrado que la calibración previa de una fibra multimodo en forma de matriz de transmisión (TM) permite la recuperación de la imagen del objeto23,24,26,27. Este concepto se ha aplicado a las imágenes endoscópicas de fluorescencia del cerebro de ratón28,29 y a las imágenes de reflectancia de campo amplio de tejidos biológicos25. El enfoque TM también se ha aplicado a un endoscopio de haz de fibras para obtener imágenes de fluorescencia27 o de transmitancia/reflectancia30,31,32 para la eliminación tanto de artefactos de pixelación como de óptica distal. Sin embargo, hasta ahora los endoscopios basados ​​en MT se han utilizado como tipo rígido en lugar de flexible28,29, principalmente porque la calibración de la MT deja de ser válida cuando las fibras se doblan o retuercen durante la inserción. Se han introducido varios enfoques para resolver esta limitación crítica. Por ejemplo, la correlación de moteado debido al efecto de memoria del haz de fibras se ha utilizado para reconstruir la imagen del objeto sin conocimiento previo del TM33,34. La optimización de la retroalimentación de las señales de dos fotones medidas en el extremo proximal permite el acceso directo a la fibra TM35, y se administra una estrella guía virtual en el lado distal para compensar dinámicamente la flexión de la fibra36,37. Se ha propuesto el uso de fibras especialmente diseñadas que sean menos sensibles a la deformación por flexión38,39,40. Si bien estos estudios han demostrado la viabilidad hasta cierto punto, limitaciones innatas como el largo tiempo de optimización, el aumento de la unidad de sonda, las limitaciones para las configuraciones de flexión y la dificultad en la fabricación de fibras ideales aún impiden la realización de endoscopios flexibles. Esencialmente, los endoscopios de fibra sin lentes anteriores requieren una calibración previa o funcionan en modo de imágenes de fluorescencia, y aún no se ha desarrollado un endoscopio ideal que satisfaga todos los requisitos críticos (flexibilidad, diámetro de sonda ultrafina, resolución microscópica e imágenes sin manchas).

Aquí, presentamos un endoscopio de fibra ultrafino y totalmente flexible que puede realizar imágenes holográficas de alta resolución de tejidos no teñidos a través de un pasaje estrecho y curvo. Nuestra sonda de endoscopio es simplemente un haz de fibras desnudas sin lentes ni escáner conectados a la punta. Por lo tanto, el diámetro del endoscopio es igual al del propio haz de fibras, que fue de 200 μm o 350 μm en el presente estudio. A diferencia de un endoscopio de haz de fibras convencional, los núcleos de fibras no son píxeles de imagen. En cambio, la fibra se coloca a cualquier distancia mayor que 400 μm de la muestra objetivo. En esta configuración única, la iluminación se realiza a través de cada núcleo de fibra, uno por uno, pero la detección la realizan todos los demás núcleos de fibra. Las ondas reflejadas de la muestra que se vuelven borrosas y se propagan a los otros núcleos de fibra se miden mediante una medición de campo holográfico32. Esto nos permite bloquear selectivamente el ruido de retrorreflexión del núcleo de iluminación. Dado que el campo holográfico medido contiene la transformada de Fourier de una función de objeto mediante difracción de Fresnel, denominamos a nuestro método "endoscopia holográfica de Fourier". Sin embargo, no se puede reconstruir una imagen del objeto a partir del campo detectado debido a los retardos de fase que varían dinámicamente de núcleo a núcleo con respecto a la flexión y torsión de la fibra. Si bien la fibra se calibró antes de su inserción en enfoques de TM anteriores, desarrollamos un algoritmo que puede identificar los complejos retrasos de fase de núcleo a núcleo y reconstruir la imagen del objeto libre de pixelación y limitada por difracción, todo al mismo tiempo sin la necesidad de cualquier calibración previa. Esto nos permitió realizar imágenes endoscópicas con una configuración de flexión arbitraria y variable. Para un objeto ubicado detrás de un pasaje estrecho y curvo, realizamos imágenes de reflectancia endoscópica con una resolución espacial microscópica de 0,85 μm para objetivos de resolución de bajo contraste. Además, logramos imágenes volumétricas en 3D que cubren el rango de profundidad de 400 a 1200 μm con una resolución axial de hasta 14 μm aprovechando la reconstrucción de imágenes holográficas. Para verificar la aplicabilidad del método propuesto para investigar muestras biológicas, realizamos imágenes con endoscopio holográfico de Fourier de tejidos de intestino de rata sin teñir que son completamente invisibles para los endoscopios convencionales en modo de reflectancia. Demostramos imágenes de vellosidades individuales con una resolución espacial y un contraste iguales o mejores que los de los microscopios de reflectancia confocales convencionales.

Nuestra configuración experimental se muestra en la Fig. 1a. Como fuente de luz se utilizó un láser de diodo (Finesse Pure, Laser Quantum) con una longitud de onda de λ = 532 nm y una longitud de coherencia de 6 mm. El haz de salida se dividió en ondas de muestra y de referencia con un divisor de haz (BS1). El haz de muestra fue reflejado por un espejo galvanómetro (GM) de dos ejes y enfocado en el plano de entrada (IP) de un haz de fibras coherente a través de una lente objetivo (OL). Se utilizaron dos tipos de haces de fibras, uno con 350 μm de diámetro (Fujikura, FIGH-10-350S) y el otro con 200 μm de diámetro (Fujikura, FIGH-10-200S). El haz de fibras de 350 μm de diámetro (1 m de largo y un radio de curvatura mínimo de 35 mm) contiene alrededor de 10.000 núcleos de fibras, cada uno de los cuales tiene un diámetro de aproximadamente 2 μm. Ajustamos el ángulo de escaneo de GM para enfocar secuencialmente el haz de iluminación en cada núcleo de fibra. Esto aseguró que el haz de iluminación (indicado en verde) viajara a través del núcleo de fibra única y saliera del plano de salida (OP) del haz de fibras a través del mismo núcleo de fibra.

una configuración experimental. El haz de salida de un láser se divide en haces de muestra y de referencia. El haz de muestra se entrega a la muestra a través del haz de fibras. La señal de retrodispersión de la muestra, indicada en amarillo para mayor claridad aunque su longitud de onda es idéntica a la onda incidente, es capturada por el haz de fibras y entregada a la cámara. El haz de referencia genera un interferograma junto con el haz de señal en la cámara. GM: espejo de escaneo galvanómetro de 2 ejes, BS1-3: divisores de haz, L1-5: lentes, OL: lente objetivo. IP y OP: planos de entrada y salida del haz de fibras, respectivamente. SP: plano de muestra. b Principio de formación de imágenes. Los caminos de iluminación y reflexión se han desplegado para dejar clara su distinción. \(\left({u}_{i},{v}_{i}\right)\) y \(\left({u}_{{{{{{\rm{r}}}}} }},{v}_{{{{{\rm{r}}}}}}\right)\): coordenadas espaciales en el haz de fibras para las vías de iluminación y detección, respectivamente; \({\phi }_{{{{{\rm{i}}}}}}}^{{{{{\rm{b}}}}}}}\left({u}_{ {{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) y \({\phi } _{{{{{{\rm{r}}}}}}}^{{{{{\rm{b}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\ rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\): retardos de fase inducidos por el haz de fibras durante la iluminación y la reflexión. , respectivamente; \({E}_{{{{{\rm{i}}}}}}}\left(x,y\right)\) y \({E}_{{{{{{\rm{ r}}}}}}}\left(x,y\right)\): los campos eléctricos incidentes y reflejados por la muestra, respectivamente; y \({E}_{{{{{\rm{cámara}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}},{ v}_{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\): el campo eléctrico detectado en la cámara.

Para separar el ruido de retrorreflexión del haz de fibras, colocamos el plano de muestra (SP) a una distancia d del OP. Esto permitió que las señales de retrodispersión de la muestra se esparcieran en el espacio y se recolectaran en núcleos distintos del núcleo de iluminación. La resolución de la imagen varía según la distancia de separación. Sin embargo, nuestro sistema siempre proporciona una mejor resolución espacial que las imágenes en modo de contacto cuya resolución está establecida por el diámetro del núcleo. Como se verificará más adelante, esto se debe a que el producto espacio-ancho de banda de nuestro sistema es mayor en un factor de 13. Por lo general, d osciló entre 400 y 1200 μm para garantizar que la aproximación de Fresnel sea válida (consulte la sección complementaria 4 para conocer la distancia mínima de trabajo). 41. En esta disposición, el haz de iluminación del OP llega al SP en forma de onda parabólica. El ángulo de la onda de iluminación parabólica en el SP varía dependiendo de la posición del núcleo de iluminación en el IP. Las ondas retrodispersadas por el objeto en SP (indicadas en amarillo) son capturadas por múltiples núcleos de fibra en el OP y devueltas al IP. Las ondas que regresan a través del IP son capturadas por el OL y entregadas a la cámara. Para obtener la amplitud y fase de las ondas de retorno, se introdujo una onda de referencia en la cámara con una configuración fuera del eje y se aplicó la transformada de Hilbert a los hologramas grabados.

El diseño detallado del proceso de formación de imágenes se muestra en la Fig. 1b. La onda incidente se centró en el núcleo de la fibra ubicado en \(\left({{{{{{\boldsymbol{u}}}}}}}} _ {{{{{\bf{i}}}}}}} {{{{{\boldsymbol{,}}}}}}{{{{{\boldsymbol{v}}}}}}}_{{{{{{\bf{i}}}}}}} \right)\) del IP experimenta un retraso de fase \({{{{{{\boldsymbol{\phi }}}}}}}_{{{{{{\bf{i}}}}}}}^ {{{{{{\bf{b}}}}}}}\left({{{{{{\boldsymbol{u}}}}}}}_{{{{{{\bf{i}} }}}}}{{{{{\boldsymbol{,}}}}}}{{{{{\boldsymbol{v}}}}}}}_{{{{{{\bf{i}} }}}}}\right)\) en el núcleo correspondiente y sale como fuente puntual en el OP. Esta fuente puntual viaja hasta el SP y se encuentra con el objeto objetivo como una onda parabólica. La ola incidente en \(\left({{{{{\boldsymbol{x}}}}}}{{{{{\boldsymbol{,}}}}}}{{{{{\boldsymbol{y}} }}}}\right)\) del SP se puede escribir como

Aquí, \(k=2\pi {\lambda }^{-1}\) es el número de onda. La onda es reflejada por la muestra objetivo que tiene la función de objeto \(O\left(x,y\right)\), que es la reflectancia de amplitud del objetivo. La onda reflejada dada por \({E}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\left(x,y{{{{{\rm{;}}}}}}{ u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)=O\left( x,y\right){E}_{{{{{\rm{i}}}}}}}\left(x,y{{{{{\rm{;}}}}}}{u }_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) se representa en la lado de transmisión de la muestra en la Fig. 1b para distinguirla claramente de la onda incidente. La onda reflejada viaja de regreso a \(\left({u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}} }}}}\right)\) del OP después de la difracción de Fresnel y regresa al IP después de experimentar un retardo de fase dependiente del núcleo de la fibra \({\phi }_{{{{{{\rm{r}}}}} }}^{{{{{{\rm{b}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{ {{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\). Después de incorporar todos estos procesos, podemos obtener el campo en la cámara, es decir, el campo detectado en el plano facetario proximal de la fibra, como

Aquí, \({\widetilde{O}}_{{{{{{\rm{M}}}}}}}\) es la transformada de Fourier de la función objeto modificada \({O}_{{{{ {{\rm{M}}}}}}}\left(x,y\right)=O\left(x,y\right){\exp }\left\{i\frac{k}{d} \left({x}^{2}+{y}^{2}\right)\right\}\), y \({\phi }_{{{{{{\rm{i}}}} }}}\left({u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\ derecha)=\frac{k}{2d}\left({{u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}}^{2}+{{v}_{{{ {{{\rm{i}}}}}}}}^{2}\right)+{\phi }_{{{{{\rm{i}}}}}}}^{{{{ {{\rm{b}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm {i}}}}}}}\right)\) y \({\phi }_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\left({u}_{{{{ {{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)=\frac{k}{2d}\left( {u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}^{2}+{v}_{{{{{\rm{r}}}}}}}^{2 }\right)+{\phi }_{{{{{\rm{r}}}}}}}^{{{{{\rm{b}}}}}}}\left({u }_{{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\) son los retardos de fase en las rutas de iluminación y reflexión, respectivamente (consulte la sección complementaria 1 para obtener la derivación detallada de la ecuación (2)). En esencia, el campo medido contiene el espectro del objeto con un factor de escala k/d y un desplazamiento espectral de \(\left({-u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{- v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\). Los términos de fase cuadrática se introducen debido a la difracción de Fresnel. Curiosamente, se absorben por separado en \({O}_{{{{{{\rm{M}}}}}}}\left(x,y\right)\), \({\phi }_{ {{{{{\rm{i}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{ {\rm{i}}}}}}}\right)\), y \({\phi }_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\left({u}_ {{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\).

Encontrar \({O}_{{{{{\rm{M}}}}}}}\left(x,y\right)\), \({\phi }_{{{{{{\ rm{i}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i} }}}}}}\right)\), y \({\phi }_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\left({u}_{{{{{{ \rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{\rm{r}}}}}}\right)\) de las ondas de reflexión medidas es generalmente una tarea difícil, especialmente cuando los retardos de fase entre los núcleos no están correlacionados. Sin embargo, la ecuación. (2) es formalmente equivalente a la configuración de imagen donde el objeto objetivo incrustado dentro de un medio aberrante está ubicado en el plano focal exacto de la lente del objetivo42. En nuestros estudios anteriores42,43,44, desarrollamos un método denominado 'acumulación de dispersión única en bucle cerrado (CLASS)' para separar la función del objeto de las aberraciones complejas inducidas por muestras y recuperar la resolución espacial ideal limitada por la difracción. Rediseñamos especialmente este algoritmo CLASS para abordar el problema actual teniendo en cuenta el muestreo pixelado por el haz de fibras y los términos de fase cuadrática. El principio de funcionamiento es construir primero la matriz de reflexión R en la que los elementos se llenan con \({E}_{{{{{{\rm{cámara}}}}}}}\left({u}_{{ {{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}};{u}_{{{{{{\rm {i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) con \(\left({u}_{{{{ {{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) y \(\left({u}_ {{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\) como índices de columnas y filas, respectivamente. Luego calculamos iterativamente las correlaciones entre las columnas y filas para identificar \({\phi }_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\left({u}_{{{{{{ \rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) y \({\phi }_{{{{ {{\rm{r}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm {r}}}}}}}\right)\), de donde obtenemos \({O}_{{{{{{\rm{M}}}}}}}\left(x,y\right )\) (consulte Métodos para obtener detalles sobre la reconstrucción de imágenes). Podemos obtener el mapa de reflectancia de la muestra objetivo mediante la relación simple \({\left|{O}_{{{{{\rm{M}}}}}}}\left(x,y\right) \right|}^{2}={\left|O\left(x,y\right)\right|}^{2}\). Este algoritmo identifica automáticamente \(\frac{k}{d}\left({x}^{2}+{y}^{2}\right)\) en \({O}_{{{{{{ \rm{M}}}}}}}\left(x,y\right)\) para los objetos dentro del rango de trabajo. Dado que la distancia d entre fibra y muestra se obtiene automáticamente a partir de los términos de fase cuadrática, también es posible reconstruir una imagen 3D a partir del registro de una única matriz de reflexión.

Los procedimientos experimentales para realizar las imágenes endoscópicas se muestran en la Fig. 2. Colocamos un objetivo de resolución de la Fuerza Aérea de EE. UU. (USAF) (Edmund, 2 ″ x 2 ″ Positivo, 1951 USAF High-Resolution Target # 58-198) en el SP. La imagen endoscópica convencional de campo completo tomada por el mismo haz de fibras se muestra en la Fig. 2h como punto de referencia (ver Métodos para más detalles). A partir de la fotografía de la superficie del haz de fibras tomada en el IP, elegimos qué núcleos de fibra iluminar (los puntos rojos en la Fig. 2a). En una configuración arbitraria de flexión de fibra, ajustamos el ángulo GM para enfocar el haz de iluminación en cada núcleo a la vez. En un experimento típico, la iluminación se realizó entre 100 y 3000 núcleos de fibras diferentes. En la Fig. 2b se muestran imágenes sin procesar de las ondas retrodispersadas de la muestra tomada en el IP para la iluminación de algunas fibras centrales representativas. Las coordenadas espaciales de estas imágenes de salida corresponden a \(\left({{{{{{\boldsymbol{u}}}}}}}_{{{{{{\bf{r}}}}}}}{ {{{{\boldsymbol{,}}}}}}{{{{{\boldsymbol{v}}}}}}}_{{{{{{\bf{r}}}}}}}\ derecha)\) en la superficie del haz de fibras. En cada imagen, el punto brillante se debe a la retrorreflexión directa del núcleo de la fibra donde se centró la iluminación. Se movían sincrónicamente con el escaneo de \(\left({{{{{{\boldsymbol{u}}}}}}}_{{{{{{\bf{i}}}}}}}{{ {{{\boldsymbol{,}}}}}}{{{{{\boldsymbol{v}}}}}}}_{{{{{{\bf{i}}}}}}}\right )\). Las ondas de señal retrodispersadas por el objeto objetivo se distribuyeron espacialmente sobre los otros núcleos en las imágenes grabadas. Eliminamos selectivamente el ruido de retrorreflexión dejando caer la señal en el píxel donde se enfocaba el ruido de retrorreflexión. Luego realizamos la transformada de Hilbert en las imágenes sin procesar en la Fig. 2b para obtener un mapa de campo complejo de las ondas retrodispersadas (Fig. 2c).

a Imagen de campo brillante del haz de fibras tomada en el IP iluminando la fuente incoherente del OP. Los núcleos de fibra donde se enfocó el haz de iluminación se indican como puntos rojos. b Imágenes sin procesar capturadas por la cámara para el escaneo de \(\left({u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm {i}}}}}}}\derecha)\). Para una mejor visibilidad, las imágenes que se muestran aquí se tomaron sin el haz de referencia, mientras que las imágenes de interferencia se registraron para las imágenes endoscópicas (consulte la sección complementaria 2 para ver imágenes de interferencia sin procesar). La barra de color indica la intensidad normalizada excluyendo el ruido de retrorreflexión. c Mapas de campo complejos \({E}_{{{{{{\rm{camera}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{r}}}}}} },{v}_{{{{{\rm{r}}}}}}};{u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_ {{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) obtenido de las imágenes de interferencia sin procesar en b. Mapa de colores circular: valores reales e imaginarios de \({E}_{{{{{{\rm{camera}}}}}}}\). d y e Retardos de fase dependientes del núcleo de la fibra \({\phi }_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{i }}}}}}},{v}_{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) y \({\phi }_{{{{{{\rm {r}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}} }}}}}\right)\), respectivamente, identificados mediante el algoritmo. La barra de color indica la fase en radianes. Barra de escala, 0,1k. f y g Lo mismo que d y e, respectivamente, pero para un objetivo de resolución de bajo contraste. h Imagen endoscópica convencional de un objetivo de la USAF tomada por la iluminación incoherente del IP. El haz de fibras estaba en contacto con la superficie objetivo. i Adición coherente de imágenes transformadas de Fourier inversas de los mapas de campo complejos en c antes de corregir los retrasos de fase dependientes del núcleo de la fibra. j Lo mismo que i pero después de la corrección. La barra de color significa amplitud normalizada. k–m Lo mismo que h–j, respectivamente, pero para un objetivo de resolución de bajo contraste. Se utilizó el haz de fibras de 350 μm de diámetro y la distancia d entre fibra y muestra fue de 500 μm para i, j, ly m. Barras de escala en aac: 50 μm. Barras de escala en j y m: 30 μm.

Las imágenes detectadas en la Fig. 2c corresponden a \({E}_{{{{{{\rm{camera}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{r} }}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}};{u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}} ,{v}_{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) en la ecuación. (2). Desde \({\phi }_{{{{{\rm{i}}}}}}}^{{{{{\rm{b}}}}}}}\left({u}_ {{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) y \({\phi }_{{{{{{\rm{r}}}}}}}^{{{{{\rm{b}}}}}}}\left({u}_{{{{{{ \rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\) varían significativamente durante la inserción de la fibra, la imagen del objeto no se puede reconstruir directamente a partir de las imágenes de la Fig. 2c. La transformada inversa de Fourier de las imágenes en la Fig. 2c dio como resultado patrones moteados y su suma coherente no mostró signos de información de la imagen (Fig. 2i). Como se describió anteriormente, construimos una matriz de reflexión a partir de las imágenes de la Fig. 2c y aplicamos nuestro algoritmo para identificar \({\phi }_{{{{{\rm{i}}}}}}}\left({ u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) y \( {\phi }_{{{{{\rm{r}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}},{v} _{{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\), que se muestran respectivamente en la Fig. 2d, e. Presentaban patrones de fases complejos, como era de esperar. Compensamos estos retrasos de fase dependientes del núcleo en las imágenes de la Fig. 2c, que luego se agregaron de manera coherente después de tener en cuenta el cambio espectral por (ui, vi) (consulte Métodos para el algoritmo y la reconstrucción de imágenes). La imagen final reconstruida que se muestra en la Fig. 2j presenta detalles finos en los Grupos 8 y 9 que eran invisibles en la imagen del endoscopio convencional en la Fig. 2h. Nuestro endoscopio pudo resolver la característica más pequeña del objetivo USAF 1951 en el primer elemento del grupo 9 teniendo una distancia de 1,56 μm entre las barras vecinas. Esto sugiere que la resolución lateral es igual o mejor que 1,56 μm. De hecho, el borde del objetivo de la USAF es lo suficientemente nítido como para evaluar completamente la resolución del endoscopio. Al analizar la función de respuesta del borde, encontramos que la resolución lateral era tan buena como 0,85 μm, que está muy cerca de la resolución teórica (0,78 μm) de nuestro sistema (consulte la sección complementaria 3). Además, no hubo pixelación en la imagen reconstruida porque las imágenes adquiridas a través de \({E}_{{{{{{\rm{camera}}}}}}}\) estaban pixeladas en la frecuencia espacial pero no en la real. espacio. Esto condujo a un aumento del producto de ancho de banda espacial en un factor de 13 en comparación con los endoscopios de modo de contacto convencionales (consulte la sección complementaria 3).

La resolución de imagen de nuestro endoscopio está determinada por el diámetro del haz de fibras D, que establece la apertura numérica (NA) en \(\alpha=n\left(D/2\right){d}^{-1}\ ), donde n es el índice de refracción del medio entre la fibra y la muestra. Cuando \(\alpha\) es mayor que la NA de la propia fibra (0,4), esta última limita la resolución espacial alcanzable. A medida que d se reduce de 1,2 mm a 400 μm, \(\alpha\) aumenta de 0,12 a 0,47 para n = 1, y el poder de resolución espacial teórico aumenta de 1,6 a 0,67 μm. En el experimento, las ondas reflejadas dentro del diámetro de \({D}_{{{{{{\rm{eff}}}}}}}=0.80D\) se utilizaron por razones de tiempo de cálculo. Por lo tanto, la resolución limitada por difracción en d = 500 μm fue de 0,78 μm, lo que se acerca al resultado experimental. El diámetro del campo de visión se estableció como \(L=\left(\lambda /n\right)d\Delta {D}^{-1}\), donde \(\Delta {D}\) = 3,2 μm es el Espaciado entre núcleos de fibra. Por lo tanto, L aumentó de 66 μm a 170 μm con un aumento en d. En el proceso de reconstrucción de la imagen, el espaciado efectivo entre núcleos se redujo a \(\Delta {D}_{{{{{{\rm{eff}}}}}}}\)= 1,5 μm debido a la síntesis de múltiples imágenes con el desplazamiento espectral de \(\left({u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i }}}}}}}\bien)\). Como resultado, L osciló entre 140 y 410 μm con un aumento en d. El campo de visión estimado en d = 500 μm fue de 170 μm, lo que concuerda bien con el resultado experimental (consulte la sección complementaria 3 para conocer el poder de resolución y el campo de visión para haces de fibras de 350 μm de diámetro y 200 μm de diámetro).

Para demostrar el beneficio de nuestro método en la eliminación del ruido de retrorreflexión, realizamos imágenes de un objetivo de resolución de la USAF de bajo contraste (Thorlabs, objetivo de prueba de la USAF Positive 1951, R1DS1P). La reflectancia del objetivo era un 10% mayor que la del fondo a una longitud de onda de 532 nm. Las imágenes endoscópicas convencionales (Fig. 2k) no mostraron ninguna estructura porque el ruido de retrorreflexión era mucho más fuerte que la señal de retrodispersión del objetivo de resolución. Por el contrario, nuestro método podría revelar claramente las estructuras objetivo (Fig. 2m). La Figura 2f, g muestra los retrasos de fase dependientes del núcleo identificados.

Demostramos imágenes microscópicas sin etiquetas a través de un pasaje estrecho y curvo. Se colocó un objeto objetivo dentro de una caja y se conectó un tubo de plástico de 80 cm de largo a un orificio en el techo de la caja (Fig. 3a, b). Los diámetros interior y exterior del tubo fueron 4,3 y 6,5 mm, respectivamente. Mientras el extremo proximal de la fibra se fijaba en el plano focal de la lente objetivo (el recuadro en la Fig. 3b), el lado distal de la fibra se insertaba a través del tubo hasta alcanzar el objetivo (Edmund, 2″ × 2″ Positivo, objetivo de alta resolución de la USAF de 1951 n.º 58-198). Se tomó una imagen endoscópica convencional cuando el haz de fibras estaba en contacto con el objetivo (Fig. 3c). Aunque esta imagen estaba pixelada y su poder de resolución era bajo, nos permitió posicionar la fibra en la región de interés. Una vez que se identificó el objetivo, retiramos el haz de fibras para establecer d dentro del rango de trabajo y registramos una matriz de reflexión escaneando los núcleos de fibras de iluminación. La imagen adquirida se muestra en la Fig. 3d, en la que la imagen reconstruida se enfoca automáticamente en el objeto objetivo y los detalles finos del Grupo 9 son claramente visibles con una resolución espacial de 1,1 μm. La distancia de separación se calculó como 800 μm a partir de la fase cuadrática de la imagen reconstruida. Este resultado confirma que nuestro endoscopio puede tomar una imagen microscópica in situ de un objeto objetivo a través de un pasaje estrecho y curvo sin calibración previa del haz de fibras.

a y b Vistas frontal y superior de la configuración experimental, respectivamente. La imagen ampliada en a: el lado distal del haz de fibras cerca de la muestra. La imagen ampliada en b: el acoplamiento de la luz al IP de la fibra desde la lente del objetivo, respectivamente. cyd Imagen endoscópica convencional y la imagen reconstruida con nuestro endoscopio, respectivamente. Barras de escala: 20 μm. La barra de color en c muestra la intensidad normalizada y la barra de color en d muestra la amplitud normalizada. e Esquema para imágenes endoscópicas de objetivos apilados. Se colocaron dos objetivos de resolución a dos profundidades diferentes, I y II, con distancias entre la fibra y la muestra de 0,6 y 1,06 mm, respectivamente. Junto al esquema se muestran imágenes reales de los objetivos en las profundidades I y II tomadas con un microscopio de campo claro convencional. f y g Imágenes endoscópicas para las profundidades de I y II, respectivamente, reconstruidas mediante un registro de matriz de reflexión única. Se utilizó un haz de fibras de 350 μm de diámetro para la adquisición de imágenes. Barras de escala: 30 μm. La barra de color significa amplitud normalizada.

Nuestro endoscopio tiene capacidad de imágenes 3D ya que nuestro algoritmo funciona como una reconstrucción de imágenes holográficas. Para los dos objetivos separados por 460 μm (Fig. 3e), tomamos una única matriz de reflexión. Nuestro algoritmo identificó la imagen objetivo desde la profundidad I (Fig. 3f), ya que esta profundidad proporcionó correlaciones más fuertes que la profundidad II al calcular los retrasos de fase dependientes del núcleo. Una vez identificados ϕi (ui, vi) y ϕr (ur, vr) para la profundidad I, aplicamos la propagación computacional de cada Ecamera (ui, vi; ui, vi) basada en el método del espectro angular41 luego de aplicar la corrección para obtener la imagen objetivo en profundidad II. Después del reenfoque numérico, salieron a la luz estructuras completamente diferentes correspondientes a la profundidad II (Fig. 3g) (consulte la Película complementaria 1 tomada mientras se escaneaba computacionalmente el plano focal). Este resultado mostró el rango de imágenes volumétricas cubiertas por una única grabación matricial. Demostramos imágenes volumétricas de partículas de TiO2 dispersas en gel de agarosa y demostramos que la resolución de profundidad de nuestro endoscopio era tan buena como 14 μm (consulte la sección complementaria 3 y la película complementaria 2).

Demostramos la obtención de imágenes endomicroscópicas de tejidos biológicos no teñidos. Se colocó un tejido intestinal extirpado de una rata sobre un portaobjetos de vidrio (ver Métodos para la preparación de la muestra). Al principio, la punta del haz de fibras se colocó cerca de la superficie de las vellosidades del intestino. La imagen adquirida por el endoscopio convencional se muestra en la Fig. 4a, en la que el contraste entre el objetivo y el fondo era demasiado bajo para discernir vellosidades. De hecho, el contraste de las vellosidades era tan bajo que podían ser vagamente visibles incluso en la imagen de transmisión (Fig. 4b) tomada iluminando desde el lado de la muestra. Luego retiramos el haz de fibras a unas 1000 μm de las vellosidades y tomamos imágenes endoscópicas de diferentes regiones. Las imágenes representativas obtenidas para las áreas circulares indicadas en la Fig. 4b se muestran en las Fig. 4c – f. El límite de las vellosidades se resuelve nítidamente con un contraste mucho mejor que la imagen del endoscopio convencional, y las estructuras de las partes internas relativamente transparentes cerca del límite son reconocibles. El mapa completo de dos vellosidades se reconstruyó uniendo múltiples imágenes tomadas para diferentes regiones (Fig. 4g). La resolución espacial obtenida a partir de la nitidez del límite fue de aproximadamente 1 μm, mucho mejor que la que puede proporcionar la colonoscopia típica. En esta demostración, el reflejo de la superficie del vidrio era dominante sobre el de la superficie del tejido. Por lo tanto, el contraste de la imagen reconstruida se generó por el reflejo de la transmisión de la superficie del vidrio a través del tejido intestinal.

a Imagen de endoscopio de reflectancia convencional tomada cuando el haz de fibras estaba en contacto con las vellosidades. b Imagen de transmisión convencional obtenida a través del haz de fibras. La iluminación LED se envió desde las vellosidades al haz de fibras. Barra de escala: 100 μm. cf Imágenes de reflectancia sin etiquetas obtenidas utilizando nuestro endoscopio holográfico para las áreas circulares indicadas en b. Barra de escala: 25 μm. g Imagen reconstruida de dos vellosidades uniendo múltiples imágenes tomadas en una amplia región de interés. Se utilizó un haz de fibras de 350 μm de diámetro para la adquisición de imágenes. Barra de escala: 100 μm.

Para demostrar imágenes de tejido en condiciones de modo de reflexión completa, colocamos un tejido de intestino de rata en gel de agarosa y llenamos el espacio entre el gel y el haz de fibras con agua (Fig. 5a). Los índices de refracción del agua y del gel de agarosa eran casi idénticos, lo que hacía que la reflexión en su interfaz fuera insignificante. Dado que un portaobjetos de vidrio que soportaba la muestra estaba ubicado muy por debajo del tejido extirpado (> 1 cm), el reflejo de la superficie del vidrio fue insignificante. Por lo tanto, la señal de reflexión capturada por el haz de fibras procedía principalmente de la superficie de los tejidos del intestino, así como del lado distal de la propia fibra. En esta geometría, el endoscopio convencional de modo de contacto no podía visualizar nada, ni la pista de la existencia de las vellosidades (Fig. 5c). Esto se debe a que la señal de reflexión de la superficie de las vellosidades quedó completamente oscurecida por la de la superficie de la fibra debido a la pequeña diferencia de índice entre el tejido y el gel de agua/agarosa. Esto muestra la dificultad para realizar imágenes endoscópicas en modo de reflectancia para tejidos biológicos. Por el contrario, nuestro endoscopio holográfico de Fourier pudo visualizar claramente los límites externos y la morfología de las vellosidades con alto contraste (Fig. 5d). Para cubrir el campo de visión amplio, movimos la punta distal del haz de fibras y tomamos imágenes consecutivamente de múltiples sitios de las vellosidades. Las imágenes grabadas se unieron para producir la imagen ampliada. A partir de la nitidez de los límites de las vellosidades, se estimó que la resolución espacial era de 2 μm. Como verdad sobre el terreno, se tomó una imagen de reflectancia confocal mediante un microscopio convencional utilizando un objetivo de tipo aire de 0,4 NA a una longitud de onda de 516 nm (Fig. 5b). La morfología general de las vellosidades y sus límites fueron casi idénticos a los resueltos por nuestra imagen endoscópica, lo que valida la capacidad de nuestro endoscopio para obtener imágenes de tejidos no teñidos. Cabe señalar que el contraste de nuestra imagen del endoscopio es ligeramente mejor que la imagen de reflectancia confocal convencional debido a la adición de la puerta de coherencia que se explica a continuación.

a Configuración de muestra. Se colocó un tejido de intestino de rata extirpado encima de un gel de agarosa espeso (espesor > 1 cm) sobre un portaobjetos de vidrio. La punta distal del haz de fibras estaba aproximadamente a 600 μm por encima de la superficie del tejido con su espacio lleno de agua. b Imagen de reflectancia convencional registrada con un microscopio confocal utilizando un objetivo de 0,4 NA a una longitud de onda de 516 nm. c Imagen del endoscopio de reflectancia en modo de contacto. d Imagen holográfica del endoscopio de Fourier. Barras de escala: 100 μm.

En esta demostración, adoptamos especialmente una fuente de luz de baja coherencia para atenuar aún más la contribución de la reflexión desde la punta distal del haz de fibras. Aunque la iluminación de un solo núcleo con detección de campo amplio puede eliminar la mayor parte del ruido de retrorreflexión, todavía existen reflejos perdidos debido a la fuga de iluminación a los otros núcleos de fibra. Incluso estos reflejos dispersos pueden tener un efecto devastador en la reconstrucción de la imagen debido al débil contraste de los tejidos del intestino en agua/gel de agarosa. El uso de una fuente de baja coherencia cuya longitud de coherencia es más corta que la distancia punta-muestra puede rechazar efectivamente estas contribuciones ya que no pueden formar una interferencia con el haz de referencia, cuya longitud de trayectoria se estableció en la muestra de tejido. Específicamente, se duplicó la frecuencia de un haz de salida de un láser pulsado (láser Yb hecho a medida, longitud de onda: 1032 nm) mediante un proceso de generación de segundo armónico para producir una fuente de luz con una longitud de onda de 516 nm y un ancho de banda de 3 nm. Esto corresponde a la longitud de coherencia de 20 μm. Para esta medición se utilizó un haz de fibras de 300 μm de diámetro (FIGH-06-300S) con una longitud de 15 cm y un número de núcleos de aproximadamente 4000. Debido a la dispersión por la óptica de imágenes y los núcleos de fibra, la activación de coherencia efectiva se amplió a aproximadamente 100 μm, que era mucho más corta que el espacio típico de 600 μm entre la punta de la fibra y la superficie del tejido. Resultó que la adición de la puerta de coherencia era fundamental para obtener imágenes de tejidos sumergidos en agua y gel de agarosa. En una condición en la que la superficie del tejido está expuesta al aire, como suele ser el caso en una investigación endoscópica típica, se espera que se reduzca la demanda de activación de coherencia. Este resultado sugiere que la capacidad de obtención de imágenes microscópicas sin etiquetas de nuestro endoscopio puede usarse potencialmente para identificar las anomalías que ocurren en la superficie de las vellosidades en una etapa más temprana que la práctica actual.

Desarrollamos un endoscopio sin lentes ultrafino totalmente flexible que puede realizar imágenes microscópicas de tejidos biológicos sin teñir a través de un pasaje estrecho y curvo. El método propuesto adopta la forma más delgada posible porque el propio haz de fibras se utiliza como sonda del endoscopio. El diámetro de la sonda fue de 350 μm o 200 μm en el presente estudio, pero se puede reducir aún más simplemente empleando un haz de fibras más pequeño. Por lo tanto, el diámetro puede ser incluso comparable al de la aguja de acupuntura más fina. Las resoluciones lateral y axial alcanzadas fueron de 0,85 μm y 14 μm respectivamente, comparables a las de los microscopios de alta resolución. La grabación de imágenes holográficas permitió la reconstrucción de objetos tridimensionales para un volumen que cubría un rango de profundidad de 400 a 1200 μm utilizando una única grabación de matriz de reflexión. Si bien conserva todos estos beneficios, nuestro endoscopio funciona como un tipo flexible en lugar de rígido porque eliminamos la necesidad de una calibración previa de la sonda de imágenes. Resolvimos los complejos retrasos de fase dependientes del núcleo directamente a partir de las imágenes tomadas durante la sesión de imágenes, lo que nos permitió navegar libremente con la sonda del endoscopio alrededor de la región de interés.

La velocidad de adquisición de imágenes volumétricas fue de 1 Hz con el uso de una cámara sCMOS porque los mapas de campo complejos requeridos pueden ser tan pequeños como 100 imágenes. La velocidad de imagen podría acelerarse hasta 20 Hz simplemente empleando una cámara CMOS de alta velocidad con una velocidad de fotogramas de 2000 Hz (consulte la sección complementaria 8). Esta implementación reducirá sustancialmente los artefactos de movimiento durante la adquisición de imágenes. La reconstrucción de imágenes tarda 2 s para procesar datos con 200 imágenes sin procesar usando una computadora de escritorio (CPU: Intel Xeon Gold 6130, 2,10 GHz, RAM: 256 GB, GPU: NVIDIA TITAN RTX D6 24 GB). Esperamos que el reemplazo completo de Matlab con el lenguaje de programación compilado como C/C++ haga que el proceso general sea mucho más rápido y sea posible la visualización en tiempo real.

La capacidad de obtener imágenes endoscópicas flexibles y sin etiquetas con un nivel de rendimiento de microscopía podría acelerar el diagnóstico de enfermedades no invasivas o mínimamente invasivas y las inspecciones industriales. Por ejemplo, nuestro endoscopio es tan delgado que se puede insertar a través de cavidades estrechas, como las diminutas vías respiratorias del pulmón y microvasos estrechos para investigaciones microscópicas. Dado que la sonda puede ser tan delgada como una aguja de acupuntura, se puede insertar directamente en los tejidos cerebrales para encontrar trastornos neurológicos con complicaciones mínimas. Nuestro endoscopio también puede facilitar una fototerapia precisa y una estimulación lumínica eficiente, ya que la luz del tratamiento se puede administrar a través del haz de fibras mientras que las imágenes endoscópicas acceden a la lesión objetivo a través de la misma sonda de imágenes. El método propuesto se combinó con la detección controlada por tiempo empleando una fuente de luz de baja coherencia para una mejor reducción del ruido de fondo. La detección controlada por tiempo permitirá obtener imágenes endoscópicas del interior de los tejidos, así como el mapeo de la morfología superficial. Dado que nuestro enfoque puede proporcionar un contraste de imagen mejor que la microscopía de reflectancia confocal convencional, este método acelerará aún más el diagnóstico de enfermedades que ocurren en lo profundo de los tejidos16,45,46. La aplicabilidad no se limita al diagnóstico médico sino que puede extenderse a las inspecciones industriales. En los semiconductores y microprocesadores modernos, los dispositivos se apilan en capas para lograr una integración máxima. Nuestro endoscopio se puede utilizar para monitorear cada paso del proceso de fabricación que ocurre dentro de las cámaras con intervenciones mínimas. La capacidad de obtención de imágenes sin etiquetas es particularmente adecuada porque el uso de tinciones químicas no es deseable debido a la preocupación de contaminar los dispositivos.

De imágenes complejas \({E}_{{{{{{\rm{camera}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}} ,{v}_{{{{{\rm{r}}}}}}};{u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{ {{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) en la Fig. 2c, construimos la matriz de reflexión R en la que los índices de columna y fila corresponden a \(\left({u}_{ {{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) y \(\left({ u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\), respectivamente. Esto se logró convirtiendo las imágenes individuales en la Fig. 2c en vectores de columna y uniéndolas para formar una matriz. Identificamos \({\phi }_{{{{{\rm{i}}}}}}}^{{{{{\rm{c}}}}}}}\left({u} _{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\) de la correlación entre los columnas y construyó una matriz corregida en la que los elementos de la matriz eran \({E}^{{{{{{\rm{c}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm {r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}};{u}_{{{{{{\rm{i}}}} }}},{v}_{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)={e}^{-i{\phi }_{{{{{{\rm{ i}}}}}}}^{c}\left({u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{ i}}}}}}}\right)}{E}_{{{{{{\rm{cámara}}}}}}}\left({u}_{{{{{{\rm{r }}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}};{u}_{{{{{{\rm{i}}}}}} },{v}_{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)\). Luego identificamos \({\phi }_{{{{{\rm{r}}}}}}^{{{{{\rm{c}}}}}}}\left({u }_{{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}\right)\) de la correlación entre las filas de la matriz corregida, que luego se aplicó para construir la matriz corregida cuyos elementos eran \({E}^{{{{{{\rm{c}}}}}}}\left({u}_{ {{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}};{u}_{{{{{{\ rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right)={e}^{-i{\phi }_{{ {{{{\rm{i}}}}}}}^{c}\left({u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{ {{{{\rm{i}}}}}}}\right)}{E}_{{{{{{\rm{cámara}}}}}}}\left({u}_{{{ {{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}};{u}_{{{{{{\rm{ i}}}}}}},{v}_{{{{{\rm{i}}}}}}}\right){e}^{-i{\phi }_{{{{{ {\rm{r}}}}}}}^{c}\left({u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}},{v}_{{{{{ {\rm{r}}}}}}}\right)}\). Estos procesos se repitieron hasta que el espectro del objeto \({\widetilde{O}}_{{{{{{\rm{M}}}}}}}\left(\frac{k}{d}\left({ u}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}+{u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}}\right),\frac{k }{d}\left({v}_{{{{{{\rm{r}}}}}}}+{v}_{{{{{{\rm{i}}}}}}} \right)\right)\) fue identificado42. Cambiamos el espectro del objeto en \(\left({u}_{{{{{{\rm{i}}}}}}},{v}_{{{{{{\rm{i}}} }}}}\right)\) para imágenes individuales, que convirtió el espectro adquirido a \({\widetilde{O}}_{{{{{\rm{M}}}}}}}\left(\ frac{k}{d}{u}_{{{{{\rm{r}}}}}}},\frac{k}{d}{v}_{{{{{{\rm{ r}}}}}}}\right)\) para todas las opciones de núcleos de iluminación. Estos espectros se sumaron y se tomó una transformada de Fourier inversa para obtener la función de objeto acumulada coherentemente \({O}_{M}\left(x,y\right)\). \(\left|{O}_{M}\left(x,y\right)\right \vert=\left|O\left(x,y\right)\right|\) se muestra en las Figs. 2j y 2m. Consulte la sección complementaria 2 para obtener detalles sobre el procesamiento de imágenes.

Las imágenes de endoscopio convencional mostradas en las Figs. 2h, k, 3c y 4a se tomaron poniendo en contacto la punta del haz de fibras con el objetivo de resolución. Esto equivale a colocar una lente con un aumento de 1x en la punta de una fibra. Se insertó un diodo emisor de luz (Modelo: M530L3, Thorlabs, longitud de onda: 530 nm) en la trayectoria del haz de muestra en la Fig. 1a y su haz de salida iluminó todo el haz de fibras. Las imágenes reflejadas se registraron con la misma cámara utilizada para las imágenes del endoscopio.

Extrajimos tejidos intestinales de ratas Sprague-Dawley de 1 a 2 días de edad. Se utilizaron ratas SD tanto machos como hembras. La parte superior del intestino delgado se extirpó rápidamente y se fijó durante 2 a 4 h a 4 °C en paraformaldehído al 4%. Después de la fijación, el tejido intestinal se lavó con solución salina tamponada con fosfato y luego se montó en un portaobjetos de vidrio con aceite de inmersión para obtener imágenes. Todos los procedimientos y protocolos experimentales anteriores se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité de Política de Investigación Animal de la Universidad de Corea.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Todos los datos relevantes están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud.

Los códigos MATLAB utilizados en este trabajo están disponibles a pedido de los autores correspondientes.

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Esta investigación fue apoyada por IBS-R023-D1, la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno coreano (MSIT) (No. 2021R1A2C2012069), el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 del Consejo Europeo de Investigación (ERC) (subvenciones no .677909, 101002406) y Fundación de Ciencias de Israel (1361/18).

Estos autores contribuyeron igualmente: Wonjun Choi, Munkyu Kang.

Centro de Espectroscopía y Dinámica Molecular, Instituto de Ciencias Básicas, Seúl, República de Corea

Wonjun Choi, Munkyu Kang, Jin Hee Hong y Wonshik Choi

Departamento de Física, Universidad de Corea, Seúl, República de Corea

Wonjun Choi, Munkyu Kang, Jin Hee Hong y Wonshik Choi

Departamento de Física Aplicada, Escuela de Ingeniería y Ciencias de la Computación Selim y Rachel Benin, Universidad Hebrea de Jerusalén, Jerusalén, Israel

Ori Katz

Instituto de Investigación en Electrotecnología de Corea, Ansan, Corea

Byunghak Lee y Guang Hoon Kim

B2LAB co., ltd, Pohang-si, Gyeongsangbuk, Corea

Byunghak Lee

Departamento de Bioingeniería, Universidad de Corea, Seúl, República de Corea

Young Woon Choi

Programa Interdisciplinario en Salud Pública de Precisión, Universidad de Corea, Seúl, República de Corea

Young Woon Choi

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Wonjun C., MK, OK, YC y Wonshik C. concibieron el proyecto. Wonjun C. y MK diseñaron la configuración experimental y realizaron los experimentos. Wonjun C., MK, YC y Wonshik C. analizaron los datos. JHH preparó muestras biológicas. Sistema láser compatible con BL y GK. Wonjun C., MK, YC y Wonshik C. prepararon el manuscrito y todos los autores contribuyeron a finalizarlo. YC y Wonshik C. supervisaron el proyecto. Wonjun C. y MK contribuyeron igualmente a este trabajo.

Correspondencia a Youngwoon Choi o Wonshik Choi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Christophe Moser y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Choi, W., Kang, M., Hong, JH et al. Endoscopio holográfico ultrafino de tipo flexible para obtener imágenes microscópicas de tejidos biológicos sin teñir. Nat Comuna 13, 4469 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32114-5

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Recibido: 16 de febrero de 2022

Aceptado: 18 de julio de 2022

Publicado: 02 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32114-5

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